Egy fiola, két célpont: Hordozható CRISPR-alapú tuberkulózisdiagnosztika 100%-os érzékenységgel

Egy, a Science Advances folyóiratban megjelent egy tanulmány egy hordozható tuberkulózis-tesztről, amely közvetlenül a köpetből, bonyolult berendezések nélkül elvégezhető. Az izotermikus DNS-amplifikációt és a CRISPR-leolvasást egyetlen kémcsőben kombinálják; két konzervatív M. tuberculosis inszerciót (IS6110 és IS1081) tesztelnek egyszerre, plusz egy emberi gént belső mintakontrollként. Egy klinikai mintákon végzett kis „vak” tesztben a teszt 100%-os érzékenységet (6/6) és 100%-os specificitást (7/7) mutatott a tenyészethez képest; a kimutatási határ ~69–81 CFU/ml szimulált köpetben. Az eredmény egy papír tesztcsíkon látható, és a reagensek liofilizáltak („hűtési lánc” nélküli tárolás).

Háttér

A WHO szerint a tuberkulózis 2023-ban körülbelül 1,25 millió ember halálát fogja okozni; a tuberkulózis ismét a vezető fertőző halálokká vált, becslések szerint 10,8 millió esettel. Ez kritikus fontosságúvá teszi a hozzáférhető és gyors diagnosztikát, különösen az erőforrásokban korlátozott környezetben.

• A jelenlegi tesztek kompromisszumot jelentenek a pontosság, a sebesség és az ár között. Az „aranystandard” tenyészet nagyon pontos, de lassú; a mikroszkópia gyors, de érzéketlen; a PCR platformok, mint például az Xpert MTB/RIF Ultra, lényegesen érzékenyebbek (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), de drága berendezéseket és patronokat igényelnek, ami korlátozza a lefedettséget.
• Miért az izotermikus és a CRISPR? Az izotermikus RPA amplifikáció 37–42 °C-on működik, és nem igényel hőciklereket – kényelmes „terepeken”. A CRISPR leolvasás (Cas12/13) fajspecificitást biztosít, és vizuális laterális áramlást („csíkolást”) tesz lehetővé komplex optika nélkül. Összességében ez az út a hordozható és olcsó PVR tesztekhez.
• Miért van szükség két MBT célpontra egyszerre (IS6110 + IS1081). Az IS6110 azM. tuberculosis komplex több kópiás inszertje, de egyes vonalakban kevés kópia található, és az IS6110 önmagában történő vizsgálata „hibázhat”. Egy második IS1081 inszert hozzáadása csökkenti a téves negatív eredmények kockázatát.
• Miért van szükség belső emberi kontrollra? A kilégzési minták tartalmazhatnak inhibitorokat és „rossz” mintákat. Az endogén emberi kontroll (pl. RNáz P/genomiális DNS) megerősíti, hogy az anyag megfelelő és a reakció nincs elnyomva – ellenkező esetben az eredmény nem tekinthető negatívnak.
• Az egyedényes formátum önmagában is fontos. Csökkenti a lépések számát, mérsékli a szennyeződés kockázatát, és megkönnyíti a laboratóriumon kívüli munkát. A tuberkulózis kezelésére szolgáló ilyen megközelítések már életképesnek bizonyultak; az új munka kiterjeszti az ötletet egy kettős célpontú formátumra belső kontrollokkal, valamint bemutatja a reagensek liofilizálását és egy tesztcsík-leolvasót.
• Mi a jelenlegi cikk értéke? A szerzők igazolták a közvetlen köpetből történő kimutatást a legegyszerűbb minta-előkészítés után, a szimulált köpetben a ~70–80 CFU/ml kimutatási határt, valamint a 100%-os érzékenységet/specificitást egy kis vak klinikai mintakészleten – ami jó „technológiai bemutató” a további többközpontú validációkhoz.

Ez hogy működik

• A tudósok az RPA-t (genetikai anyag gyors izotermikus amplifikációja 37 °C-on) a Cas13a/Cas12a „vágó” enzimekkel kombinálták. Miután kiválasztották a vezető RNS-eket, úgy konfigurálták a rendszert, hogy két MBT célpontot célozzon meg egyszerre, és párhuzamosan az emberi DNS-sel (ellenőrizve, hogy egyáltalán van-e anyag a mintában, és a reakció nem „állt-e le”).
• Az összes kémiai reakció egyetlen kémcsőbe kerül; az inkubáció után az eredményt fluoriméterrel vagy egy laterális áramlású tesztcsíkon olvassák le – lényegében mint egy expressz tesztnél.
• A köpet feldolgozása leegyszerűsödött melegítésre és egy rövid centrifugálásra – nukleinsav-kivonók nélkül. A legszűkebb körülmények között a szerzők a centrifuga manuális alternatíváit is tárgyalják.

Amit a tesztek mutattak

• Kimutatási határ: 69,0 CFU/ml (H37Rv törzs) és 80,5 CFU/ml (BCG) „tüskés” köpetben. Nem észleltek keresztreaktivitást más baktériumokkal/gombákkal.
• Klinikai környezet (vak minták): 13 valós gyakorlatból származó mintán - 100%-os érzékenység (6/6) és 100%-os specificitás (7/7) a szóráshoz képest. Összehasonlításképpen, ugyanazon a kiten a GeneXpert Ultra 100%/86%-ot mutatott.
• Technikai árnyalatok: a két leolvasási lehetőség közül a Cas13a működött jobban (az „egyedényes” formátum esetén érzékenyebb, mint a Cas12a). Ráadásul két Mtb célpont párhuzamos tesztelése csökkenti a téves eredmények kockázatát.

Miért szükséges ez?

A mai tesztek kompromisszumot jelentenek a pontosság, a sebesség és az elérhetőség között: a tenyésztés nagyon pontos, de lassú; a tamponvizsgálatok gyorsak, de pontatlanok; a PCR-rendszerek, mint például a GeneXpert, pontosak és gyorsak, de drága eszközöket és patronokat igényelnek. Az új CRISPR-megközelítés célja, hogy áthidalja ezt a hiányt: 37°C-on működő terepi diagnosztika, papírcsík-leolvasásokkal, és a reagensek hűtés nélküli tárolásának lehetőségével.

Korlátozások és mi a következő lépés

Ez egy korai demonstráció egy kis klinikai kísérletsorozaton – nagyméretű, többközpontú vizsgálatokra van szükség (beleértve a HIV-koinfekciót, gyermekeknél, kevés baktériummal járó formákat és különböző MBT-vonalakat). A szerzők külön megjegyzik, hogy magában a „terepi” változatban az asztali centrifugát egy teljesen manuális megoldással kell majd helyettesíteni. Maga az architektúra – „két célpont + belső kontroll” egy kémcsőben – azonban már bizonyította működőképességét, és egyértelmű utat nyit a tömeges felhasználás érdekében történő finomítás felé.

Forrás: Alexandra G. Bell et al. Egyszerűsített CRISPR-alapú teszt a tuberkulózis kimutatására közvetlenül a köpetből, Science Advances, online 2025. augusztus 6. (11. kötet, 32. szám). DOI: 10.1126/sciadv.adx206